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Jun 12, 2023

Explorando ND

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 12226 (2023) Cite este artículo 210 Accesos 1 Detalles de Altmetric Metrics El metabolismo energético bacteriano se ha convertido en un objetivo prometedor para la próxima generación

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 12226 (2023) Citar este artículo

210 Accesos

1 altmétrica

Detalles de métricas

El metabolismo energético bacteriano se ha convertido en un objetivo prometedor para la quimioterapia antituberculosa de próxima generación. Una estrategia para obstaculizar la producción de ATP es inhibir las oxidasas respiratorias. La cadena respiratoria de Mycobacterium tuberculosis comprende un citocromo bcc:aa3 y un citocromo bd ubiquinol oxidasa que requieren un enfoque combinado para bloquear su actividad. Anteriormente se había informado que un compuesto de tipo quinazolina llamado ND-011992 inhibe de manera ineficaz las bd oxidasas, pero actúa como bactericida en combinación con inhibidores de la citocromo bcc:aa3 oxidasa. Debido a la similitud estructural de ND-011992 con los inhibidores del complejo respiratorio I de tipo quinazolina, sospechamos que este compuesto también es capaz de bloquear otros complejos de la cadena respiratoria. Aquí, sintetizamos ND-011992 y un derivado de bromo para estudiar su efecto sobre los complejos de la cadena respiratoria de Escherichia coli. Y, de hecho, se descubrió que ND-011992 inhibe el complejo respiratorio I y la bo3 oxidasa además de las oxidasas bd-I y bd-II. Todos los valores de CI50 están en el rango micromolar bajo, y la inhibición del complejo I proporciona el valor más bajo con un CI50 de 0,12 µM. Así, ND-011992 actúa tanto sobre las quinona reductasas como sobre las quinol oxidasas y podría ser muy adecuado para regular la actividad de toda la cadena respiratoria.

La tuberculosis causada por Mycobacterium tuberculosis es una de las enfermedades infecciosas con más causas de muerte a nivel mundial y afecta principalmente a los países en desarrollo1. Con la aparición de la COVID-19, la tuberculosis fue reemplazada brevemente como la principal causa de muerte por una sola enfermedad infecciosa, pero volverá a desempeñar un papel importante en el futuro. Dado que la medicación convencional está mostrando cada vez menos éxito debido al desarrollo de resistencia a múltiples fármacos (MDR) y extensa resistencia a los medicamentos (XDR)2, existe una necesidad urgente de nuevos medicamentos. Los complejos enzimáticos de M. tuberculosis implicados en el metabolismo energético que sintetizan la gran mayoría del ATP se han convertido recientemente en foco de interés para el desarrollo de nuevos antibióticos3,4,5. Una dificultad importante para controlar la tuberculosis es que M. tuberculosis puede entrar en una fase de no replicación6 cuando se expone a tensiones, como la falta de oxígeno, y puede persistir en esta fase durante mucho tiempo. Para este mecanismo de supervivencia son importantes los complejos enzimáticos responsables del metabolismo energético, como la bd oxidasa, que se regula positivamente en estas condiciones7. La cadena respiratoria de M. tuberculosis comprende dos oxidasas terminales8. En condiciones de alta tensión de oxígeno se produce la citocromo bcc:aa3 oxidasa, mientras que en condiciones de baja tensión de oxígeno la bd oxidasa está activa. Estudios anteriores demostraron que la inhibición de ambas oxidasas terminales de M. tuberculosis dio como resultado una supresión eficaz del crecimiento de micobacterias tolerantes a los antibióticos9. La inhibición de la citocromo bcc:aa3 oxidasa se logra mediante el fármaco candidato Telacebec (Q203) que ya ha sido probado en un ensayo de eficacia clínica de fase 2a10. Para evitar que M. tuberculosis utilice la ruta alternativa para la transferencia de electrones que mantiene la respiración y, por tanto, la síntesis de ATP11, es necesario inhibir la citocromo bd oxidasa en combinación con la citocromo bcc:aa3 oxidasa. Recientemente, se identificó un pequeño compuesto orgánico N-(4-(4-(trifluorometil)fenoxi)fenil)quinazolin-4-amina (también llamado ND-011992) que demostró inhibir la citocromo bd oxidasa9. Sin embargo, el uso potencial de ND-011992 como fármaco antituberculoso se ve obstaculizado por sus pobres propiedades farmacocinéticas, como ya se mencionó en la publicación original9. Por lo tanto, se necesita con urgencia la optimización de la estructura principal para mejorar el potencial inhibidor y la farmacocinética de ND-0119928,9.

Además, uno de nosotros informó que un inhibidor similar basado en quinazolina, 4-N-[2-(4-fenoxifenil)etil]-quinazolin-4,6-diamina (EVP4593), inhibe el complejo mitocondrial I, otro importante complejo enzimático de la cadena respiratoria12. La estructura central aromática común de ND-011992 y EVP4593 abrió la cuestión de si ND-011992 es específico de la bd oxidasa o si también podría inhibir el complejo I (Fig. 1).

Estructuras y coeficientes de partición calculados (CLogP) de EVP4593, Telacebec, ND-011992 (1) y derivado de bromo (2).

En este trabajo, se investigó la inhibición del complejo I, así como de las oxidasas terminales bo3 y bd de la cadena respiratoria en Escherichia coli por ND-011992 y su derivado que contiene bromo, el compuesto 2 (Fig. 1). El compuesto 2 tiene un valor de clogP elevado, lo que significa una mayor lipofilicidad y un mayor parecido con el clogP del candidato a fármaco establecido Telacebec en comparación con el compuesto 1. Además, la motivación detrás de la incorporación de un derivado halogenado surgió de la posibilidad de que si el compuesto 1 demostrara una buena unión a Una de las enzimas investigadas, el compuesto bromado 2, sería muy adecuado para localizar el sitio de unión de esta enzima mediante microscopía crioelectrónica. Con este fin, estamos planeando realizar extensos estudios de relación estructura-actividad en nuestro próximo trabajo. Las enzimas antes mencionadas son muy adecuadas para este estudio, ya que las bd oxidasas de E. coli muestran una alta similitud estructural con la bd oxidasa de M. tuberculosis8. Además, el complejo respiratorio I de E. coli es una forma estructural mínima del complejo mitocondrial I. Nuestros estudios revelan que ND-011992 inhibe el complejo reductor de quinona I y las oxidasas oxidantes de quinol.

ND-011992 (1) y un derivado de ND-011992 (2) con un bromo que sustituye al H en la posición 6 (Fig. 2) se sintetizaron en una reacción de un solo paso modificada a partir de un procedimiento de Lee et al.9 como se describe en la sección 'Métodos'.

Síntesis en un solo paso de ND-011992 (1) y derivado de bromo (2).

Se hicieron reaccionar 4-cloroquinazolina o 6-bromo-4-cloroquinazolina, respectivamente, con 4-(4-(trifluorometil)fenoxi)anilina y carbonato de potasio en DMSO. Todos los materiales de partida están disponibles comercialmente y la reacción produce productos con rendimientos moderados (75% para 1 y 45% para 2). Ambos compuestos brutos se purificaron mediante cromatografía ultrarrápida en gel de sílice. Los derivados de cloro y yodo de este compuesto (no descritos con más detalle en este trabajo) se sintetizaron de manera análoga. Los compuestos se caracterizaron mediante RMN 1H y 13C, así como mediante EM (consulte las figuras complementarias S1 a S6).

Esta reacción constituye una reacción de sustitución aromática nucleófila (SNAr), donde el cloro del reactivo de quinazolina actúa como un grupo saliente que es desplazado por el reactivo de arilamina nucleófila. El mecanismo de reacción propuesto se muestra en la Fig. 3.

Mecanismo propuesto para la formación de ND-011992 (1) y derivado de bromo (2).

Se determinó el efecto inhibidor de ND-011992 sobre la actividad NADH oxidasa de membranas de la cepa BL21*Δcyo de E. coli. Esta actividad está mediada principalmente por las NADH deshidrogenasas primarias y las oxidasas terminales13. La cepa BL21*Δcyo carece cromosómicamente de la bo3-oxidasa y contiene las oxidasas homólogas bd-I y bd-II como únicas oxidasas terminales14. BL21*Δcyo se cultivó en medio completo, las células se recogieron y se rompieron y las membranas citoplasmáticas se prepararon mediante centrifugación diferencial. Con NADH como sustrato, los electrones podrían ingresar a la cadena respiratoria a través del complejo I o a través de la NADH deshidrogenasa alternativa que no convierte energía, NDH-II. La titulación de la actividad NADH oxidasa con ND-011992 reveló una IC50 de 0,43 µM (Fig. 4a). En segundo lugar, se utilizó deamino-NADH (d-NADH) como sustrato para determinar la actividad d-NADH oxidasa de las membranas BL21*Δcyo. El d-NADH es un sustrato específico del complejo I que impide la entrada de electrones a la cadena respiratoria a través del NDH-II15,16. En este caso, la titulación con ND-011992 reveló una IC50 significativamente menor de 0,26 µM (Fig. 4b). El cambio de la IC50 en dependencia del sustrato ya indica una inhibición de alta afinidad del complejo respiratorio I por ND-011992. Para controlar específicamente la inhibición del complejo I, se midió la actividad d-NADH:decil-ubiquinona oxidorreductasa de las membranas citoplasmáticas de la cepa CBO.

Actividades oxidorreductasa de membranas de E. coli BL21*Δcyo en diversas concentraciones de ND-011992. (a) Actividad NADH oxidasa, (b) Actividad d-NADH oxidasa y (c) Actividad d-NADH: decil-ubiquinona oxidorreductasa de membranas CBO de E coli representadas frente a la concentración de ND-011992.

La cepa CBO carece cromosómicamente de ambas bd oxidasas, dejando a la bo3 oxidasa como la única oxidasa terminal17. La actividad de la bo3 oxidasa se inhibió completamente mediante la adición de KCN 1 mM al ensayo18. Se añadió decilubiquinona como aceptor de electrones externo que recoge electrones del conjunto de quinonas que se reduce mediante la reacción del complejo I. Con d-NADH como sustrato, el complejo I es la única enzima activa en el ensayo. Aquí, la IC50 hacia ND-011992 se determinó en 0,12 µM (Fig. 4c). Así, ND-011992 exhibe una afinidad submicromolar hacia el complejo I, lo que lo convierte en un buen inhibidor de esta enzima. La doble diferencia en la CI50 de ND-011992 en las actividades de la d-NADH oxidasa (Fig. 4b y c) podría deberse a diferencias entre las dos cepas de E. coli o a la contribución adicional de las bd oxidasas a la d -Actividad NADH oxidasa. Se puede concluir que ND-011992 es un buen inhibidor del complejo respiratorio I en la membrana bacteriana con una IC50 de 0,12 µM. Para validar la afirmación de que ND-011992 es un inhibidor bueno y específico de las bd oxidasas, a continuación investigamos su efecto inhibidor sobre las oxidasas aisladas.

La bd-I oxidasa de E. coli se aisló de la cepa BL21*Δcyo/pET28b( +)::cydAhisBX13, la bd-II oxidasa de la cepa BL21*Δcyo/pET28b( +)::appChisBX19 y la bo3 oxidasa de la cepa BL21*Δcyo/pET28b ( +)::cyoAhisBCD (ver 'Métodos'). El índice "his" indica la subunidad de los complejos enzimáticos decorados con una etiqueta His. Todas las cepas se cultivaron en condiciones óxicas en medio completo. Las células se recogieron y se rompieron y las membranas citoplasmáticas se prepararon mediante centrifugación diferencial. Las proteínas de membrana se extrajeron con el detergente lauril maltosa neopentilglicol (LMNG) y se purificaron hasta homogeneidad mediante cromatografía de afinidad, intercambio aniónico y exclusión por tamaño (véanse las figuras complementarias S7-S9).

La afinidad de ND-011992 hacia las oxidasas aisladas se determinó mediante la inhibición de la actividad duroquinol:oxígeno oxidorreductasa medida como disminución de la concentración de oxígeno20. La IC50 para bd-I y bd-II oxidasa se determinó en 0,63 y 1,3 µM, respectivamente (Fig. 5a y b). Por tanto, existe una diferencia doble significativa en la unión de ND-011992 hacia las dos oxidasas homólogas. Además, la CI50 es mayor que la del complejo respiratorio I, lo que demuestra que el compuesto se une mejor al complejo I que a la bd-I y a la bd-II oxidasa. La incorporación de bromo al compuesto provocó cambios significativos en la inhibición. La CI50 del derivado de bromo 2 a bd-I oxidasa aumentó ligeramente a 1,03 µM en comparación con la obtenida con ND-011992. Por el contrario, el compuesto bromado mostró una unión diez veces mejor a la oxidasa bd-II con una CI50 de 0,13 µM (Fig. 5c yd). Sorprendentemente, 2 no tuvo ningún efecto sobre la actividad NADH oxidasa de las membranas de E. coli en el rango de concentración micromolar. La explicación más razonable es que el 2 no puede penetrar en la membrana biológica debido a la voluminosa sustitución del bromo y, por tanto, no encuentra su objetivo.

Actividad duroquinol:oxidorreductasa de oxígeno de oxidasas terminales aisladas de E. coli a diversas concentraciones de ND-011992 y el compuesto 2. (a) y (b) muestran la inhibición de las oxidasas bd-I y bd-II por ND-011992. (c) y (d) muestran la inhibición de las oxidasas bd-I y bd-II por 2. La inhibición de la bo3 oxidasa con ND-011992 se muestra en (e).

Debido a que se afirmó que ND-011992 es un inhibidor específico de las bd oxidasas9, también determinamos su IC50 hacia la bo3 oxidasa aislada. Al igual que las bd oxidasas, la bo3 oxidasa también es una quinol oxidasa. De hecho, la CI50 de 2,47 µM es de dos a cuatro veces mayor que la de las bd oxidasas (Fig. 5e); sin embargo, todos los valores de CI50 están en un rango similar.

En estos experimentos las tres oxidasas sólo se inhiben parcialmente, especialmente en la valoración con ND-011992 queda aproximadamente un 20% de actividad residual (Fig. 5). La inhibición parcial se encuentra cuando un complejo enzima-inhibidor todavía es capaz de producir un producto. Esto indica claramente que ND-011992 actúa como un inhibidor reversible que no se une exactamente al mismo sitio que el sustrato, sino muy cerca. Esto es de esperarse debido a las estructuras claramente diferentes de los inhibidores y del sustrato. Además, los sitios de unión de quinonas de todas las enzimas investigadas tienen una arquitectura completamente diferente (ver 'Discusión'), por lo que no es de esperar una inhibición competitiva del respectivo sitio de unión al sustrato.

La inhibición del complejo respiratorio I de E. coli por ND-011992 en concentraciones submicromolares fue inesperada. Para que ND-011992 o un derivado del mismo se utilice como posible fármaco antituberculoso, se debe garantizar que la sustancia no inhiba también el complejo mitocondrial I. Para verificar esto, investigamos la inhibición de la actividad NADH oxidasa de las membranas. de mitocondrias del corazón bovino (Fig. 6). El paso limitante de la velocidad de esta cascada de reacciones es el complejo respiratorio I. La actividad NADH oxidasa se inhibió con una CI50 de 3,27 µM. De nuevo se observa una actividad residual de aproximadamente el 20%. La inhibición del complejo I mitocondrial es aproximadamente 27 veces menor que la del complejo I bacteriano. Esto muestra que ND-011992 es un material de partida adecuado para desarrollar derivados más eficaces y específicos que inhiban específicamente las bd oxidasas bacterianas.

Actividad NADH oxidasa de membranas mitocondriales bovinas en diversas concentraciones de ND-011992.

Investigamos el efecto de ND-011992, que ha sido descrito como un inhibidor de bd oxidasas9, en varios complejos enzimáticos de la cadena respiratoria aeróbica de E. coli. Los valores de CI50 de ND-011992 para el complejo respiratorio I, la bo3 oxidasa y ambas bd oxidasas de E. coli están todos en el rango micromolar bajo. Así, ND-011992 no es un inhibidor específico que actúe con alta afinidad sobre un objetivo, pero inhibe las quinona reductasas y las quinol oxidasas de la cadena respiratoria. Todos estos complejos enzimáticos tienen distintas diferencias en la arquitectura de sus sitios de unión a quinonas. La ubiquinol oxidasa del citocromo bo3 de E. coli contiene un surco hidrofóbico en el lado periplásmico de la membrana. Este lado de oxidación de quinol está formado por una subunidad21,22. El grupo de cabeza quinol interactúa con los residuos conservados de Asp, Arg e His, y las primeras cinco unidades de la cadena lateral de isopreno del sustrato natural ubiquinol-8 están sujetas en forma de V mediante tres hélices transmembranosas. Se demostró que las bd oxidasas se unen y oxidan el ubiquinol con la ayuda de un dominio de bucle Q hidrófilo que se encuentra en el lado periplásmico de la membrana8,14,19,23,24,25. Este dominio se ubica encima de la parte transmembranosa de la misma subunidad26,27. La posición exacta del ubiquinol unido aún no se conoce, pero la estructura de la oxidasa bd-II de E. coli con un inhibidor del sitio quinol unido, la auraquina D, sugiere la unión del ubiquinol en una posición similar19. El grupo de cabeza polar de auraquina interactúa con un residuo de Asp conservado y su cadena hidrofóbica participa en varias interacciones hidrofóbicas con residuos del bucle Q y la región transmembranosa de la misma subunidad. Por el contrario, el sitio de reducción de ubiquinona del complejo respiratorio I está formado por varias subunidades que forman una gran cavidad que se extiende desde la membrana hidrofóbica hasta el llamado brazo periférico del complejo I que contiene los cofactores de transferencia de electrones. El grupo principal de ubiquinona está unido por Tyr conservado y residuos de His enterrados profundamente al final de la cavidad28,29,30. En el complejo I de E. coli, la cadena lateral de isopreno de la ubiquinona-8 llena toda la cavidad y enfrenta varias interacciones hidrofóbicas28.

Debido a la diferente disposición estructural de los sitios de unión de quinona, es razonable suponer que ND-011992 actúa principalmente a través de su hidrofobicidad y estructura de relleno de espacio para unirse y bloquear el acceso a los sitios activos. Sorprendentemente, ND-011992 inhibe la reducción de quinonas como se encuentra en el complejo respiratorio I, y la oxidación de quinol, como está presente en las quinol oxidasas con eficacia similar. Por tanto, el compuesto presenta un amplio espectro de objetivos putativos. Esto lo convierte en una herramienta interesante para, por ejemplo, cerrar eficientemente toda la cadena respiratoria. Por otro lado, puede utilizarse como punto de partida para desarrollar inhibidores más específicos. La molécula está disponible gratuitamente a través de uno de los autores (DL) previa solicitud razonable.

Sin embargo, se detectaron diferencias sutiles en la inhibición de los distintos complejos enzimáticos de la cadena respiratoria. ND-011992 muestra el mejor poder inhibidor hacia el complejo I con una IC50 de 0,12 µM (Fig. 4). Las bd oxidasas se inhiben con una eficacia de cinco a once veces menor. Sorprendentemente, la CI50 para bd-I (0,63 µM) es dos veces menor que para bd-II (1,3 µM). Además, el derivado de bromo 2 tiene una IC50 diez veces menor (0,13 µM) respecto a bd-II que ND-011992 (Fig. 5). Esto podría deberse a la presencia de un residuo de Lys cargado positivamente en la subunidad grande de la bd-II oxidasa (K287) que se reemplaza por un residuo de Gln neutro en bd-I (Q287) en el lado putativo de unión a Q de la bd. oxidasas. Esto convierte a este compuesto en una herramienta atractiva para estudiar el sitio de unión de quinol de la bd-II oxidasa mediante microscopía crioelectrónica.

Lo más interesante es que el complejo I mitocondrial se inhibe con una eficacia 27 veces menor que el complejo I de E. coli (IC50 = 0,12 frente a 3,27 µM). Además, la inhibición de las bd oxidasas bacterianas, que no tienen homólogos en las mitocondrias, sigue siendo cinco o tres veces más eficaz que la del complejo mitocondrial. Por lo tanto, existe una buena posibilidad de que una mayor optimización estructural de ND-011992 conduzca al desarrollo de inhibidores aún más específicos y potentes. También es necesaria la optimización de los clientes potenciales para mejorar las propiedades farmacocinéticas no tan destacadas de ND-011992.

A la luz de los resultados inhibidores de ND-011992 (1) y el derivado de bromo 2, llegamos a la conclusión de que estas dos moléculas pueden considerarse nuevas sondas químicas para las enzimas convertidoras de quinona/quinol debido a su capacidad para detener por completo la respiración. Con este trabajo pretendemos contribuir al “objetivo 2035”, una ambiciosa iniciativa de grupos académicos y farmacéuticos para desarrollar sondas de moléculas pequeñas para cada proteína del proteoma31.

Los reactivos disponibles comercialmente se adquirieron de Alfa Aesar, Millipore Sigma y Acros Organics. La configuración de la reacción incluyó cristalería secada en horno, placa agitadora magnética y barra agitadora, un termómetro y una manta calefactora. Las reacciones se controlaron mediante cromatografía en capa fina utilizando gel de sílice Analtech HLF UV254. Las placas de TLC se visualizaron usando una lámpara UV. La cromatografía ultrarrápida se realizó con Acros Organics 0,035–0,070 mm, gel de sílice de 60 Å como fase estacionaria.

Los datos de ClogP se obtuvieron utilizando la herramienta de propiedades químicas en ChemDraw.

Los datos de RMN 1H y 13C se tomaron en un espectrómetro de RMN Agilent VnmrJ4 de 400 MHz y se registraron en ppm frente al disolvente de RMN (CDCl3) o TMS como estándar interno. Los datos espectrales se informan en el siguiente formato: (1) espectroscopia de 1H-NMR: desplazamientos químicos (multiplicidad, constante de acoplamiento y número de protones); (2) Espectroscopia de 13C-NMR: desplazamiento químico. Los cambios químicos (δ) se informaron en partes por millón (ppm) y se determinaron en relación con el estándar interno TMS (δ 0,0 ppm). Las multiplicidades se abreviaron de la siguiente manera: s = singlete, d = doblete, t = triplete, q = cuarteto, dd = dobletes de doblete, m = multiplete, br = amplio. Los datos de GC/MS se obtuvieron utilizando el sistema GCMS Agilent 6890N/5973.

4-cloroquinazolina (CAS: 5190-68-1, 164 mg, 0,987 mmol), 4-(4-(trifluorometil)fenoxi)anilina (CAS: 57478–19-0, 256 mg, 0,987 mmol) y carbonato de potasio ( 135 mg, 0,987 mmol) se disolvieron en 7 ml de DMSO. La reacción se sometió a reflujo a 110 °C durante 21 h. La mezcla de reacción se concentró al vacío, se disolvió en DCM y se lavó con solución de ácido acético al 5 % (2x), agua (1x) y salmuera (1x) y se secó sobre sulfato de sodio (Na2SO4). La capa orgánica se concentró al vacío para producir 0,381 g de producto bruto (rendimiento del 75%). El producto bruto se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en gel de sílice usando un sistema disolvente EA:DCM 1:1 para producir 281 mg de producto recogido como un sólido blanco. Peso molecular: 381,36 g/mol. El producto purificado higroscópico necesitaba secarse en un horno a 110 °C durante la noche para evaporar las moléculas de agua observadas en la RMN de protones. Rango de punto de fusión: 155,9–187,5 °C. RMN 1H (400 MHz, CDCl3) δ ppm 8,791 (s, 1H), 7,958–7,939 (d, 1H), 7,906–7,886 (d, 1H), 7,857–7,816 (m, 1H), 7,798–7,759 (m , 2H), 7,620–7,577 (m, 3H), 7,432 (br. s, 1H), 7,151–7,077 (m, 3H). RMN 13C (100 MHz, CDCl3) δ ppm 154,909, 152,260, 134,571, 134,571, 133,054, 133,054, 129,199, 127,173, 127,135, 126,785, 123,644, 120.624, 120.624, 120.077, 177.725, 177.725, 114.970. EI-MS: m/z 381,1 [M+] encontrado en el pico (tiempo de retención) de 27,691 a 29,548 min.

6-bromo-4-cloroquinazolina (CAS: 38267–96-8, 477 mg, 1,97 mmol), 4-(4-(trifluorometil)fenoxi)anilina (CAS: 57478–19-0, 502 mg, 1,97 mmol), y se disolvieron carbonato de potasio (265 mg, 1,97 mmol) en 7 ml de DMSO. La reacción se sometió a reflujo a 110 °C durante 31 h. La mezcla de reacción se lavó con solución de ácido acético al 5% (2 veces), agua (1 veces) y salmuera (1 veces) y la capa orgánica se concentró al vacío. El producto bruto se purificó mediante cromatografía ultrarrápida en gel de sílice usando un sistema disolvente EA:DCM 1:1 para producir 409 mg (45 % de rendimiento) recogidos como un sólido marrón. Peso molecular: 460,25 g/mol. El producto purificado higroscópico debía secarse en horno a 110 °C durante ~ 2 h 40 min. Rango de punto de fusión: 206,7–207,7 °C. RMN 1H (400 MHz, CDCl3) δ ppm 8,766 (s, 1H), 8,094–8,089 (d, 1H), 7,897–7,869 (dd, 1H), 7,821–7,799 (d, 1H), 7,758–7,735 (d , 2H), 7,599–7,577 (d, 2H), 7,528 (br. s, 1H), 7,137–7,074 (m, 4H). RMN 13C (100 MHz, CDCl3) δ ppm 206,966, 156,889, 155,076, 152,268, 148,640, 136,210, 134,693, 130,367, 127,142, 127,104, 127,066, 127.028, 123.909, 120.366, 119.743, 117.725.

Para determinar la enzima se utilizaron membranas citoplasmáticas de la cepa de E. coli BL21*Δcyo que carece cromosómicamente de los genes cyoABCD que codifican la citocromo bo3 oxidasa y de la cepa CBO que carece cromosómicamente de los genes cydABX y appCBX que codifican la citocromo bd-I y bd-II oxidasa, respectivamente. actividad en la membrana13,17,19. Se aisló la citocromo bo3 ubiquinol oxidasa de la cepa de E. coli BL21*Δcyo/pET28b( +)::cyoAhisBCD con los genes que codifican la oxidasa en un plásmido de expresión. Se aisló el citocromo bd-I ubiquinol oxidasa de la cepa BL21*Δcyo/pET28b( +)::cydAhisBX con los genes que codifican la bd-I oxidasa en un plásmido de expresión14. Se aisló el citocromo bd-II ubiquinol oxidasa de la cepa BL21*Δcyo/pET28b( +)::appChisBX con los genes que codifican la bd-II oxidasa en un plásmido de expresión19. Los cultivos celulares se cultivaron aeróbicamente en matraces con deflectores de 2 litros, cada uno de los cuales contenía 800 ml de medio LB a 37 °C. La expresión génica se indujo a una DO600 de aproximadamente 2 mediante la adición de isopropil β-D-1-tiogalacto-piranósido 400 µM. Las células se recogieron 2 h después de la inducción mediante centrifugación y se almacenaron a -80 °C19.

Todos los pasos se llevaron a cabo a 4 °C. Se homogeneizaron 40 g de células congeladas por choque (peso húmedo) en un volumen seis veces mayor de ácido 3-(N-morfolino)propanosulfónico (MOPS) 20 mM, NaCl 20 mM, fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) 0,5 mM, pH 7,0 y unos pocos granos. de DNasa I en un homogeneizador de teflón en vidrio. Las células se rompieron con tres ciclos en un homogeneizador de alta presión (1250 bar, Maximator HPL6, Maximator GmbH) y los restos celulares se eliminaron mediante centrifugación (4 °C, 10'000 rpm, 30'000 × g; 20 min, Rotor 25,50, Avanti J-26S XP). Las membranas se obtuvieron del sobrenadante mediante ultracentrifugación (4 ° C, 50'000 rpm, 250'000 × g, 70 min, Rotor 60Ti, Optima LE80-K, Beckman-Coulter). Las membranas sedimentadas se resuspendieron en una proporción de 1:1 (p/v) con MOPS 20 mM y NaCl 20 mM, pH 7,0 en un homogeneizador de teflón en vidrio.

La preparación de ubiquinol oxidasa del citocromo bd-I y del citocromo bd-II a partir de E. coli se describió previamente13,19. Para la purificación de la ubiquinol oxidasa del citocromo bd-I de E. coli, se extrajeron las proteínas de la membrana con el detergente LMNG y se cargaron en una columna Probond Ni2+-IDA. Las proteínas se eluyeron de la columna lavada mediante un gradiente lineal de imidazol. Las fracciones de los picos agrupadas se concentraron y se aplicaron en una columna de intercambio iónico ResourceQ en un gradiente de NaCl. Las muestras concentradas se aplicaron en una columna de cromatografía de exclusión por tamaño HiPrep 16/60 Sephacryl S-300 HR. Las fracciones máximas se combinaron y almacenaron a una concentración final de 2 mg/ml en MOPS 20 mM, NaCl 20 mM, LMNG al 0,003 %, pH 7,013. Para la purificación de la ubiquinol oxidasa del citocromo bd-II de E. coli, se extrajeron las proteínas de la membrana con LMNG y se cargaron en una columna Probond Ni2+-IDA. Las proteínas se eluyeron de la columna lavada con imidazol 260 mM. Las muestras concentradas se aplicaron sobre una columna de cromatografía de exclusión por tamaño HiLoad 16/60 Superdex de 200 pg. Las fracciones máximas se combinaron y almacenaron a una concentración final de 2 mg/ml en MOPS 20 mM, NaCl 20 mM, LMNG al 0,003 %, pH 7,019. Para la purificación de la ubiquinol oxidasa del citocromo bo3 de E. coli, las proteínas de la membrana se solubilizaron con LMNG al 2% (p/v) durante 60 minutos a 4 °C. Después de la centrifugación (4 °C, 50'000 rpm, 250'000 × g, 15 min, Rotor 60Ti, Optima LE80-K, Beckman-Coulter), el sobrenadante se cargó en una columna de cromatografía de afinidad Ni2+ (ProBond, 25 ml, Life Technologies) equilibrado en MOPS 50 mM, NaCl 500 mM, imidazol 50 mM, PMSF 0,5 mM, LMNG al 0,005 %, pH 7,5. La columna se lavó con el mismo tampón que contenía imidazol 92 mM. Las proteínas unidas se eluyeron con imidazol 284 mM. Las fracciones máximas se reunieron y se concentraron hasta 0,5 ml. La proteína concentrada se aplicó a cromatografía de exclusión por tamaño en una columna Superose 6 (GE Healthcare) equilibrada en MOPS 50 mM, NaCl 20 mM, PMSF 0,5 mM, LMNG al 0,005 %, pH 7,5. Se reunieron las fracciones que contenían la bo3 oxidasa y se concentraron hasta 20 mg/ml.

La actividad (d-)NADH oxidasa de las membranas citoplasmáticas se determinó con un electrodo de oxígeno tipo Clark (Oxyview System, Hansatech Instruments) a 30 °C19. Se añadieron 5 µl de suspensiones de membrana (50 mg/ml) a 2 ml de MOPS 20 mM, NaCl 20 mM, pH 7,0. La reacción no enzimática se determinó después de la formación de una línea base estable. La reacción se inició mediante la adición de 5 µl de (d-)NADH (0,5 M) y las velocidades catalíticas se corrigieron para la reacción no enzimática. Después de 1 min, la reacción se inhibió añadiendo varias cantidades (0,01–50 µM) de ND-011992. Cada punto de datos se analizó por triplicado. La concentración de proteínas de las membranas se determinó mediante el método biuret32. Se proporciona la desviación estándar de cada medida.

La actividad d-NADH:decil-ubiquinona oxidorreductasa de las membranas citoplasmáticas se midió como una disminución de la concentración de d-NADH a 340 nm utilizando un ε de 6,3 mM-1 cm-1 (cubeta QS, d = 1 cm, Hellma; TIDAS S500 , J&M Aalen) 15. Se añadieron 10 µl de suspensión de membrana (100 mg/ml) a 1 ml de MES/NaOH 50 mM, NaCl 50 mM, MgCl2 5 mM, pH 6,0. La actividad de la bo3 oxidasa se inhibió mediante la adición de KCN 1 mM. Se añadió d-NADH 150 μM después de 30 s de incubación. La reacción se inició después de 1 min mediante la adición de decilubiquinona 400 µM. Las velocidades se corrigieron para la reacción no enzimática. Después de 1 min, la reacción se inhibió añadiendo varias cantidades (0,01–50 µM) de ND-011992. Cada punto de datos se analizó por triplicado. Se proporciona la desviación estándar de cada medida.

La actividad duroquinol:oxígeno oxidorreductasa de E. coli bd-I, bd-II y bo3 oxidasa aislada se determinó monitoreando el consumo de oxígeno con un electrodo de oxígeno tipo Clark (Oxyview System, Hansatech Instruments)20,33. Todos los pasos se realizaron a 30 °C. La cámara de reacción se llenó con 2 ml de MOPS 20 mM, NaCl 20 mM, LMNG al 0,003 %, pH 7,0. Después de la formación de una línea de base estable, se agregaron 10 µl de ditiotreitol (DTT) (1 M) y 5 µl de duroquinona en etanol (100 mM) y se incubaron durante 1 min. Se determinó la velocidad de reacción no enzimática. Se agregaron 10 µl de enzima en LMNG (2 mg/ml) para iniciar la reacción. Las velocidades se corrigieron para la reacción no enzimática. Después de 1 minuto, la reacción se inhibió agregando varias cantidades (0,01–50 µM) de ND-011992 y 2, respectivamente. Cada punto de datos se midió por triplicado. Se proporciona la desviación estándar de cada medida.

La actividad NADH oxidasa de mitocondrias aisladas de corazón bovino se determinó con un electrodo de oxígeno tipo Clark a 30 °C34. Se colocaron en la cámara de reacción 50 µl de membranas mitocondriales en 2 ml de sacarosa 0,44 M, Tris 20 mM, EDTA 2 mM, pH 7,4. Después de la formación de una línea base estable, se agregaron 20 µl de NADH (0,5 M) para iniciar la reacción. Después de 1 min, la reacción se inhibió añadiendo varias cantidades (0,01–50 µM) de ND-011992. Cada punto de datos se analizó por triplicado. Se proporciona la desviación estándar de cada medida.

Los datos fuente subyacentes a las Figs. 4, 5, 6 y otros datos están disponibles a través de los autores correspondientes previa solicitud razonable.

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El trabajo en el laboratorio de TF fue apoyado por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fundación Alemana de Investigación) a través de la subvención 278002225/RTG 2202. DL reconoce fondos del Programa de becarios de la facultad del Centro Reves de Estudios Internacionales y del Departamento de Química William & Mary.

Financiamiento de Acceso Abierto habilitado y organizado por Projekt DEAL.

Instituto de Bioquímica, Universidad Albert Ludwig de Friburgo, Friburgo, Alemania

Jan Kägi, Johannes Schimpf y Thorsten Friedrich

Departamento de Química, William & Mary, Williamsburg, VA, EE. UU.

Willough Sloan y Dana Lashley

Departamento de Microbiología Celular, Universidad Hohenheim, Stuttgart, Alemania

Hamid R. Nasiri

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JK y JS purificaron las enzimas, WS y DL sintetizaron los compuestos, JK adquirió y analizó los datos cinéticos. JK y DL prepararon cifras. TF, DL y HN diseñaron el estudio y analizaron los datos. JK, DL, HN y TF escribieron el manuscrito.

Correspondencia a Dana Lashley o Thorsten Friedrich.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Kägi, J., Sloan, W., Schimpf, J. et al. Explorando ND-011992, un inhibidor de tipo quinazolina dirigido a quinona reductasas y quinol oxidasas. Informe científico 13, 12226 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-39430-w

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Recibido: 02 de junio de 2023

Aceptado: 25 de julio de 2023

Publicado: 28 de julio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-39430-w

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